eIF4E重編程可變剪接

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2023-06-12
異常剪接通常歸因于剪接因子(SF)突變,并與包括急性髓系白血?。ˋML)在內(nèi)的惡性腫瘤有關(guān)。發(fā)現(xiàn)了一種與突變......


異常剪接通常歸因于剪接因子(SF)突變,并與包括急性髓系白血?。?/span>AML)在內(nèi)的惡性腫瘤有關(guān)。發(fā)現(xiàn)了一種與突變無關(guān)的方法,即真核轉(zhuǎn)錄起始因子eIF4E,也能廣泛地重編程可變剪接(AS)。本文于20232月發(fā)表在《EMBO JOURNAL》期刊上。

 

技術(shù)路線:


 

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

1、eIF4E過表達(dá)通過其RNA輸出功能影響剪接因子的蛋白水平

作為研究eIF4E在剪接中可能作用的第一步,作者檢查了先前收集的內(nèi)源性核eIF4E RIP-seq數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集來自侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤LY1細(xì)胞系,其中核eIF4E與約3000個轉(zhuǎn)錄本相關(guān)。作者分析顯示,eIF4E與約100RNA相關(guān),這些RNA編碼參與剪接調(diào)節(jié)的因子,其中53RNA編碼主要剪接體的組分,包括SF3B1U2AF1,這些因子在AML中經(jīng)常突變。有趣的是,STRING分析揭示所有主要的剪接復(fù)合體的顯著富集,根據(jù)剪接組的不同,FDR范圍從0.00162.19×1049不等(圖1A)。這個結(jié)果促使作者分析內(nèi)源性eIF4E是否可以調(diào)節(jié)剪接因子的產(chǎn)生,從而調(diào)節(jié)剪接。

為探究潛在的eIF4E剪接軸,作者基于以下幾個原因優(yōu)先使用U2OS細(xì)胞進(jìn)行研究。首先,與上述淋巴瘤細(xì)胞不同,U2OS細(xì)胞具有內(nèi)源性eIF4E水平,這與健康的志愿者細(xì)胞相似,使作者能夠測量eIF4E過表達(dá)的影響。其次,在細(xì)胞核中觀察到內(nèi)源性和過表達(dá)的eIF4E,這與剪接和細(xì)胞質(zhì)中的潛在作用一致(圖1B-H)。第三,eIF4E在這些細(xì)胞的capping、CPA、核RNA輸出和翻譯中發(fā)揮著公認(rèn)的cap - dependent作用。最后,淋巴瘤和U2OS細(xì)胞之間這些相互作用的保守性表明這是eIF4E的一般功能,而不是淋巴瘤特有的現(xiàn)象??紤]到這些,作者生成了3個穩(wěn)定的2FLAG-eIF4E過表達(dá)或vector對照細(xì)胞株。首先確定eIF4E是否調(diào)節(jié)SFs的水平。WB顯示,在2FLAG-eIF4E細(xì)胞中,SF3B1、U2AF1、U2AF2、PRPF6、PRPF8、PRPF19、PRPF31、SNRNP200蛋白水平較Vector對照組升高約2 ~ 3倍(圖1C)。CyclinD1和Mcl1作為陽性對照,而b-actin作為陰性對照,因?yàn)樗鼈儾皇莈IF4E的靶標(biāo)(圖1C)。與過表達(dá)相反,使用CRISPR-eIF4E或CRISPR-Ctrl U2OS細(xì)胞系檢測結(jié)果顯示內(nèi)源性eIF4E敲低會降低這些SFs的水平(圖1D)。這些發(fā)現(xiàn)表明內(nèi)源性eIF4E影響剪接機(jī)制的產(chǎn)生,因此,eIF4E對SFs的影響并不局限于以eIF4E升高為特征的環(huán)境。總之,eIF4E依賴的方式可以驅(qū)動SFs的產(chǎn)生。eIF4E靶向的SFs存在于每個主要的剪接體復(fù)合體中(圖1A和1E)。

接下來探究eIF4E是否通過核輸出的機(jī)制影響SFs蛋白的產(chǎn)生。作者從核裂解物中進(jìn)行eIF4ERIP以確定eIF4E是否與U2OS細(xì)胞中SFs編碼的RNA結(jié)合。在IP過程中,核裂解物與甲醛交聯(lián)以防止重配,并通過RT-qPCR監(jiān)測RNA。觀察到含有SF3B1,SNRNP200,PRPF6,PRPF8,PRPF31,U2AF1,U2AF2的內(nèi)源性核eIF4ERIP相比于input,被富集了約2到4倍(圖1F)。鑒于這種相互作用,作者研究了這些SFs編碼RNA是否為eIF4E依賴核輸出的靶標(biāo)。為此,作者使用上述三種不同的細(xì)胞系,通過RT-qPCR檢測2FLAG-eIF4E細(xì)胞中相對于Vector對照的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分的RNA水平,發(fā)現(xiàn)它們都在eIF4E過表達(dá)后胞質(zhì)/核比率增加了~2倍,表明eIF4E過表達(dá)增加了它們的核輸出(圖1G)。分級質(zhì)控采用半定量PCR檢測U6snRNA和tRNAMet,其分別表示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分(圖1G)??傊?,這些發(fā)現(xiàn)表明,eIF4E增強(qiáng)SFs編碼RNA核輸出,這為eIF4E介導(dǎo)的SFs蛋白產(chǎn)生的升高提供了一種機(jī)制。

除了通過核RNA輸出來驅(qū)動SFs的產(chǎn)生外,eIF4E還可能間接驅(qū)動轉(zhuǎn)錄和/或改變SFs編碼RNA的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性,作為驅(qū)動其蛋白質(zhì)產(chǎn)生的平行手段。然而,作者注意到文獻(xiàn)中典型的eIF4E靶點(diǎn),eIF4E過表達(dá)不調(diào)節(jié)任何RNA的總水平(圖1H)。因此,eIF4E不影響這些SF編碼轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄或RNA穩(wěn)定性。


1eIF4E通過其核運(yùn)輸活性改變SF景觀

 

為分析eIF4E依賴的RNA輸出與其翻譯功能對SF蛋白產(chǎn)生的相對貢獻(xiàn),作者使用了一個功能分離突變體。eIF4ES53A突變體具有完全結(jié)構(gòu),結(jié)合m7Gcap,促進(jìn)eIF4E依賴的翻譯和野生型eIF4E;然而,它不能促進(jìn)依賴eIF4E的核內(nèi)RNA輸出。作者比較了2FLAG-eIF4E、S53A突變體和Vector對照的SFs蛋白產(chǎn)量。檢測了每個細(xì)胞系的3個穩(wěn)定克隆,并注意到野生型和S53AeIF4E表達(dá)水平相似(圖2A)。正如預(yù)期的那樣,作為eIF4E-RNA輸出的既定目標(biāo),如CCND1,S53A突變體不能刺激細(xì)胞cyclinD1蛋白的產(chǎn)生,其水平與Vector對照組相似,而在野生型eIF4E表達(dá)的細(xì)胞中,其水平如預(yù)期的那樣升高??傊瑢τ谒鶞y試的SFs,S53A突變體沒有像野生型eIF4E那樣促進(jìn)蛋白表達(dá),這證實(shí)了eIF4E在SFs蛋白升高中具有核輸出作用。

為更深入地研究一些SFs在RNA輸出和翻譯水平上共同調(diào)控的可能性,作者使用多聚體裝載來直接測量翻譯效率,即每個轉(zhuǎn)錄本裝載的核糖體數(shù)量(圖2B)。如預(yù)期的,2FLAG-eIF4E和Vector細(xì)胞的整體多核糖體特征是不可區(qū)分的(圖2B)。在較重的餾分中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本,每個轉(zhuǎn)錄本有更多的核糖體,因此比在較輕的餾分中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率更高。用RT-qPCR比較了2FLAG-eIF4E和Vector U2OS細(xì)胞系中單體、輕質(zhì)和重質(zhì)多核糖體部分的SF編碼RNA含量(圖2B)。預(yù)計在翻譯水平上受到影響的RNA在重核糖體部分會增加,同時在輕核糖體和單體部分會減少。發(fā)現(xiàn)ACTB mRNAs沒有因?yàn)閑IF4E的表達(dá)而發(fā)生改變,而陽性對照MYC和VEGF則如預(yù)期的那樣轉(zhuǎn)移到較重的核糖體中。PRP31、U2AF1、SNRNP200或PRPF6轉(zhuǎn)錄物的核糖體負(fù)荷沒有變化。然而,PRPF8、SF3B1和U2AF2 mRNAs的特點(diǎn)是eIF4E依賴性地轉(zhuǎn)移到重多核糖體,并在輕核糖體和單體部分減少(圖2B,中間部分)。與S53A突變體觀察到的蛋白水平一致,觀察到這里的大多數(shù)eIF4E目標(biāo)是核輸出目標(biāo);然而,少數(shù)目標(biāo)在輸出和翻譯水平上都對eIF4E敏感,使得它們對eIF4E水平更加敏感。

綜上所述,eIF4E與許多SF編碼RNA相互作用并促進(jìn)其核出口。此外,eIF4E并沒有調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性。對S53A突變體的研究強(qiáng)烈支持eIF4E的核RNA輸出功能在驅(qū)動SF蛋白生產(chǎn)中的主要作用,但對一些SFs來說,也有翻譯的貢獻(xiàn),使這些后一種RNA對eIF4E失調(diào)更加敏感。


2分析S53AeIF4E突變體對其改變SF景觀能力的影響及其在翻譯中的作用

 

2、eIF4EAML細(xì)胞系和原發(fā)性AML標(biāo)本中驅(qū)動SFs的產(chǎn)生

為從遺傳學(xué)角度剖析eIF4E在AML背景下的作用,并與U2OS進(jìn)行比較,以確定這些eIF4E機(jī)制是否在不同的細(xì)胞類型中是保守的,構(gòu)建了eIF4E或Vector NOMO-1穩(wěn)定細(xì)胞系。NOMO-1 eIF4E細(xì)胞產(chǎn)生的eIF4E蛋白水平和定位與高eIF4E AML標(biāo)本相似(圖3A)。相比于對照組,這些SFs蛋白水平在NOMO-1 eIF4E細(xì)胞中上調(diào)(圖3A)。而使用eIF4E inhibitor ribavirin的效果則相反(圖3B)。因此,eIF4E對SFs的調(diào)控也適用于AML細(xì)胞。

接下來,研究原發(fā)性AML標(biāo)本中eIF4E狀態(tài)是否與SFs水平相關(guān)。如圖3C所示,結(jié)果和AML細(xì)胞類似,相比于健康或正常組,eIF4E高表達(dá)的AML患者組SFs蛋白水平顯著升高(圖3C)。因此,這些SF的升高并不是AML患者標(biāo)本的普遍特征,而是與eIF4E水平相關(guān),這與在U2OS和NOMO-1細(xì)胞中的研究一致。


3eIF4EAML中重編程SF景觀

 

3、eIF4E在物理上與剪接體相互作用

隨后檢測eIF4E是否與SFs相互作用,為eIF4E可能影響剪接的提供額外手段。在RIPs之前,核裂解物用甲醛交聯(lián),以防止處理過程中的重新組合。觀察到內(nèi)源性eIF4E與U1、U2、U4、U5和U6snRNAs免疫共沉淀,相比于input,在U2OS細(xì)胞(圖1F)以及NOMO-1細(xì)胞(圖3D)的核裂解物中富集了約3至10倍。內(nèi)源性eIF4E與陰性對照(GAPDH和ACTB)無關(guān)。此外,在U2OS或NOMO-1細(xì)胞中eIF4E過表達(dá)后,UsnRNAs的水平?jīng)]有改變,這表明eIF4E沒有導(dǎo)致更多剪接體的產(chǎn)生(圖1H和3E)。鑒于UsnRNAs在剪接體中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和催化作用,作者研究了eIF4E是否與剪接體的蛋白質(zhì)組分物理相關(guān),結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性eIF4E與U2OS(圖4A)和NOMO-1細(xì)胞(圖4B)中每個主要剪接體復(fù)合體的蛋白組分發(fā)生免疫沉淀,但不沉淀陰性對照。因此,正如在eIF4E依賴capping和CPA中觀察到的那樣,eIF4E促進(jìn)SFs的產(chǎn)生可能是為了增加其與它們的蛋白質(zhì)形式物理相互作用的能力。總之,eIF4E與幾個主要剪接體的SF和UsnRNAs結(jié)合,并在AML和U2OS細(xì)胞環(huán)境中提高了SF蛋白水平。因此,eIF4E被定位為在不同的細(xì)胞環(huán)境中調(diào)節(jié)剪接,這表明這可能是eIF4E的一個廣泛適用的特性。

 

4eIF4E與剪接體的相互作用是RNAm7Gcap敏感的

如上文所述進(jìn)行免疫沉淀,只是由于RNAse步驟,U2OS細(xì)胞的核裂解物沒有甲醛交聯(lián),然而,即使在沒有交聯(lián)的情況下,在未處理的對照組中,SFs和eIF4E之間也觀察到相同的相互作用(圖4A vs 4C)。觀察到SF3B1,U2AF1,U2AF2,PRPF6和PRPF8都存在于未處理的對照中,并且這種相互作用在RNAse處理后減少了約5倍(圖4C)。分離對照表明,作為核標(biāo)志物的Lamin在這些核裂解物中富集,而MEK1作為細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志物缺乏,此外,在處理或未處理的樣本中,eIF4E均未與Lamin免疫沉淀(圖4C)。因此,eIF4E-SF相互作用需要完整的RNA。

考慮到RNAse處理同時針對底物m7Gcap的pre-mRNAs和UsnRNAs,作者研究了用m7Gcap的類似物處理的影響,這將破壞m7Gcap的mRNA相互作用而不影響UsnRNA介導(dǎo)的相互作用。進(jìn)行eIF4ERIPs作為m7GpppG或陰性GpppG對照的功能,并通過WB監(jiān)測SF的關(guān)聯(lián)(圖4D)。關(guān)于RNAse處理,核裂解物沒有甲醛交聯(lián),eIF4E在m7GpppG或GpppG處理的樣品中都能免疫沉淀自身(圖4D)。此外,eIF4E-4EBP1的相互作用沒有受到m7GpppG或GpppG的影響,eIF4E-IP與陰性對照H2B也沒有影響。相對于GpppG對照組,eIF4E與PRPF6、U2AF3和SF3B1之間的相互作用被m7GpppG處理減少了2-5倍(圖4D);此外,HuR/ ELAVL1-eIF4E復(fù)合物在m7GpppG處理下也減少了約5倍(圖4D)。鑒于eIF4E通過m7Gcap相互作用與大多數(shù)RNA相關(guān),這些研究表明,eIF4E和SF的相互作用是由底物m7GcapRNA介導(dǎo)和/或穩(wěn)定的。這些結(jié)果表明,eIF4E招募了選定的m7Gcap的RNA到剪接體,并且/或者在那里穩(wěn)定了它們的相互作用。


4eIF4ERNA和帽依賴的方式與剪接機(jī)制發(fā)生物理相互作用

 

5、單獨(dú)過表達(dá)eIF4E足以改變剪接程序

基于上述發(fā)現(xiàn),作者監(jiān)測了eIF4EU2OS細(xì)胞整體水平剪接的影響。使用rMATS觀察到約760個轉(zhuǎn)錄物的約890個剪接事件被改變(FDR-adjusted P-value < 0.15; inclusion differences of > 0.05 or < 0.05),使用更嚴(yán)格的截斷值(Pvalue< 0.1, inclusion level differences of > 0.1 or < 0.1),觀察到493個轉(zhuǎn)錄物的555個剪接事件(圖5B)。在RNA-Seq實(shí)驗(yàn)中,共檢測到TPM大于10的5738個被注釋的轉(zhuǎn)錄物,表明約15%的被注釋的轉(zhuǎn)錄物是以eIF4E-dependent的方式進(jìn)行差異剪接的。SE是最頻繁的事件(約55%),其次是MXE事件(約30%)(圖5A)。聚類熱圖顯示所有類型的剪接事件僅基于eIF4E水平被分離(圖5B)。GO分析顯示,這些轉(zhuǎn)錄本參與的GO條目包括細(xì)胞周期、膜運(yùn)輸、DNA修復(fù)和微管細(xì)胞骨架組織。PPI富集分析與GO一致,排名靠前的是細(xì)胞周期,RNA代謝和膜運(yùn)輸(圖5C)。這些結(jié)果表明單獨(dú)過表達(dá)導(dǎo)致AS景觀改變。


5 eIF4E過表達(dá)驅(qū)動了大規(guī)模的剪接重編程

 

6、在AMLeIF4E水平與差異剪接程序相關(guān)

接下來研究了eIF4E依賴性剪接在AML中的相關(guān)性,因?yàn)樵?/span>AML中用利ribavirin靶向eIF4E提供了臨床益處,包括在早期臨床試驗(yàn)中AML患者中的一部分得到緩解。第一步,作者分析了來自437AML患者樣本和17份來源于人臍帶血的正常CD34+細(xì)胞樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)(圖6A-C)。通過RNA-Seq數(shù)據(jù)對樣本進(jìn)行了預(yù)篩選,以確保樣本不攜帶AML中報告的主要突變,即U2AF1、SRSF2SF3B1的突變,使用正常CD34+細(xì)胞作為eIF4E水平基準(zhǔn),將AML標(biāo)本分為高eIF4E組和正常eIF4E組(圖6A-B)。在rMATS分析中,選擇10eIF4E水平最高的AML標(biāo)本和11eIF4E水平正常的標(biāo)本,即與正常CD34+細(xì)胞中的水平重疊或低于其水平(圖6A-C)。相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)顯示,與11名eIF4E水平最低的AML患者(1396天,圖6C)相比,10名高eIF4E的AML患者的總生存期急劇下降(中位生存期136天,圖6C)。用rMATS比較這些高eIF4E和正常eIF4E標(biāo)本的剪接譜,觀察到~1,600個差異剪接事件,影響到~1,500個RNA(FDR-adjusted Pvalue< 0.1, absolute value of inclusion level differences of > 0.1),如果降低閾值((absolute inclusion value difference of > 0.05 and FDR-adjusted Pvalue< 0.15),則有~12,000個差異剪接事件影響~4,600個轉(zhuǎn)錄物(圖6D)。對這些AS事件進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析,發(fā)現(xiàn)AML患者eIF4E表達(dá)狀態(tài)與MXE事件密切相關(guān),在監(jiān)測MXE事件時,20/21例AML標(biāo)本的eIF4E水平是聚集的基礎(chǔ)(圖6E)。與U2OS細(xì)胞相似,觀察到eIF4E依賴的MXE靶點(diǎn)的前GO富集項(xiàng)與U2OS數(shù)據(jù)集中的高度相似:細(xì)胞周期,DNA修復(fù),膜運(yùn)輸和RNA代謝,PPI富集于有絲分裂中心體、膜運(yùn)輸和notch信號通路(圖6F)。U2OS和AML數(shù)據(jù)集中所有eIF4E依賴的剪接靶點(diǎn)的交集獲得了一組核心的約450個常見RNA靶點(diǎn)(圖7A)。類似的,GO和PPI分析顯示它們也富集到細(xì)胞周期,DNA修復(fù),膜運(yùn)輸,染色質(zhì)修飾,適應(yīng)性免疫系統(tǒng),MYC激活等(圖7B)。


6 AMLeIF4E依賴的AS事件

 

7、eIF4E AS靶向的一個子集與核eIF4E發(fā)生物理相互作用

作者使用RT–qPCR驗(yàn)證了圖7A中核心拼接目標(biāo)中的幾個eIF4E誘導(dǎo)的可變剪接事件(圖7C)。作者調(diào)查了eIF4E是否在剪接體之前(或與剪接體一起)被招募到pre-mRNA上?或者這些eIF4E-轉(zhuǎn)錄物的聯(lián)系是否是剪接產(chǎn)物特異性的。為解決這個問題,使用甲醛交聯(lián)進(jìn)行核eIF4ERIPs并使用特異性引物RT-qPCR分析RNA含量。結(jié)果與用底物和產(chǎn)物RNA的引物獲得的RNA的水平進(jìn)行了比較,后者作為正?;瘜φ铡S^察到,eIF4ERIPs與尚未經(jīng)歷目標(biāo)剪接事件("未剪接")的轉(zhuǎn)錄本,以及那些已經(jīng)經(jīng)歷了剪接事件("已剪接")的IL1B、IL4R、IKBKB、FAAP20和MAPK8IP3富集(圖7D)。這些發(fā)現(xiàn)表明eIF4E在至少某些剪接靶點(diǎn)的剪接中起直接作用。此外,這些研究首次表明eIF4E與pre-mRNA結(jié)合,這對eIF4E的功能具有重要意義。


7識別和驗(yàn)證核心剪接網(wǎng)絡(luò)以及與pre-mRNAs AS靶點(diǎn)的物理相互作用

 

總之,本研究證實(shí),核eIF4ESF編碼的RNA有物理聯(lián)系,并驅(qū)動它們的核輸出,這些轉(zhuǎn)錄物的核輸出增強(qiáng)反過來又增加了它們對翻譯機(jī)器的可用性,并提高了SF蛋白的水平,并且eIF4E在整體水平重建了細(xì)胞SFs(圖7E)。

 

參考文獻(xiàn):

Ghram M, Morris G, Culjkovic-Kraljacic B, Mars JC, Gendron P, Skrabanek L, Revuelta MV, Cerchietti L, Guzman ML, Borden KLB. The eukaryotic translation initiation factor eIF4E reprograms alternative splicing. EMBO J. 2023 Feb 27:e110496. doi: 10.15252/embj.2021110496. Epub ahead of print. PMID: 36843541.