ACSL4缺乏癥對鐵死亡介導的急性腎損傷具有保護作用

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-03-15
通過(guò)對AKI小鼠和正常小鼠腎臟的RNA序列分析,發(fā)現?;?輔酶a合成酶長(cháng)鏈家族(ACSL4)差異表達,本研究探討ACSL4在A(yíng)KI中的作用......


2012年首次發(fā)現鐵死亡會(huì )導致急性腎損傷(AKI)。但其在AKI中的作用機制尚不清楚。通過(guò)對AKI小鼠和正常小鼠腎臟的RNA序列分析,發(fā)現?;?/span>-輔酶a合成酶長(cháng)鏈家族(ACSL4)差異表達,本研究探討ACSL4AKI中的作用。本文于是20222月發(fā)表于《Redox Biology》,IF=9.986。

本文技術(shù)路線(xiàn):

       


本研究主要內容:

1、ACSL4AKI腎組織中高表達

RNA-seq測序結果顯示,在I/ R誘導小鼠AKI的腎組織中,在鐵死亡相關(guān)的幾條關(guān)鍵通路,如谷胱肽過(guò)氧化物酶4 (GPX4)、鐵抑制蛋白1 (FSP1)、ACSL4通道等,只有ACSL4表達上調(Fig 1A)。Q-PCR、WB、免疫組化檢測ACSL4表達水平。發(fā)現ACSL4 mRNA和蛋白質(zhì)水平在I/R和fa誘導的AKI小鼠腎組織中均上調(Fig. 1B–E)。此外,在FA-AKI和I/R-AKI小鼠中,ACSL4 mRNA水平與BUN和CRE呈顯著(zhù)正相關(guān)(Fig. 1F,G)。因此,ACSL4在A(yíng)KI中呈高表達,并與AKI嚴重程度呈正相關(guān)。

Fig1  AKI患者ACSL4表達上調

 

2、HIF-1α結合ACSL4啟動(dòng)子,負向調控ACSL4

分析RNA-seq數據分析顯示HIF-1信號通路富集(Fig. 2A)。HIF-1信號在AKI中被廣泛報道。此外,HIF-1α激動(dòng)劑可抑制AKI。WBRT-PCR結果顯示,AKIHIF-1αHIF-2α表達下調,ACSL4表達上調(Fig. 2B)。然后用低氧(1% O2)誘導HIF表達,探討其對ACSL4的影響。缺氧可上調HIF-1αHIF-2α的蛋白和mRNA水平而下調ACSL4的水平(Fig. 2C,D)。此外,shHIF-1α/2α伴侶蛋白ARNTmRNA水平未被shHIF-1α/2α敲除,而略有升高,可能是代償性升高。然而,敲低HIF-1α能顯著(zhù)上調ACSL4的表達水平(Fig 2E. F)。同樣的,HIF-1α抑制劑BAY 87-2243-a上調ACSL4 mRNA水平。然而,HIF-2α抑制劑PT2385并沒(méi)有上調ACSL4的mRNA水平(Fig. 2G)。此外,敲低HIF-1α可上調HK-2細胞對鐵死亡的敏感性,而抑制ACSL4可逆轉其作用(Fig 2H)。HIF-1α基因敲除后,CCL2的mRNA水平升高(Fig. 2I)。用染色質(zhì)免疫沉淀法探討HIF-1α的調控機制。首先將HIF-1α過(guò)表達質(zhì)粒轉染到HK-2細胞。熒光素酶實(shí)驗表明HIF-1α抑制ACSL4的表達(Fig. 2J)。然后,在21%或1% O2條件下分離HK-2細胞的細胞質(zhì)和細胞核。結果發(fā)現,HIF-1α和ACSL4分別在細胞核和細胞質(zhì)中表達(Fig. 2K)。最后,Chip實(shí)驗發(fā)現HIF-1α可以結合ACSL4的啟動(dòng)子并干擾ACSL4的表達(Fig. 2L)。綜上所述,HIF-1α可以結合ACSL4啟動(dòng)子,對ACSL4進(jìn)行負向調控。AKI中下調HIF-1α可導致AKI中ACSL4的高表達,從而誘發(fā)鐵死亡。

Fig.2  HIF-1α結合ACSL4啟動(dòng)子,負向調控ACSL4

 

3、在I/ r誘導的AKI中,敲除ACSL4可保護腎臟

建立ACSL4腎小管條件敲除小鼠,研究ACSL4AKI中的作用。ACSL4基因敲除效果得到證實(shí),結果顯示,與ACSL4F/F小鼠相比,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟組織中ACSL4蛋白及mRNA表達水平顯著(zhù)下調(Fig. 3A and B)。然后,在ACSL4F/FCdh16Cre-ACSL4F / F老鼠用I/ r誘導AKI。免疫熒光染色、免疫組化染色和PCR結果顯示,ACSL4cdh16crea - acsl4f /F小鼠腎臟中的表達水平下調,尤其是在腎小管上皮細胞中,因為ACSL4與腎小管上皮標志物細胞角蛋白18 (CK18)共定位(Fig. 3C-E)。Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠的GPX4和Ptgs2 mRNA表達水平分別上調和下調(Fig. 3E)。GPX4是一種重要的抗氧化過(guò)氧化物酶,它的失活直接導致鐵死亡。而Ptgs2也是一種已知的鐵死亡增加標記物。因此,這些結果證實(shí)了Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠對鐵死亡的抑制作用。此外,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著(zhù)降低(Fig. 3F) 。BUN和CRE含量均顯著(zhù)降(Fig. 3G)。此外,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟的病理?yè)p傷減輕(Fig. 3H), TUNEL染色的 (Fig.3I)表明ACSL4敲除對I/ r誘導的AKI具有保護作用。因此,在腎小管中敲除ACSL4可以通過(guò)靶向鐵死亡來(lái)抑制I/ r誘導的AKI。


Fig. 3  敲除腎ACSL4AKI有保護作用

 

4. Cdh16cre - ACSL4F/F抑制I/ r誘導AKI的炎癥反應

炎癥也被認為是AKI的關(guān)鍵因素。鐵死亡是一種促炎因子,招募巨噬細胞,引起AKI的炎癥。RNA序列分析顯示,在ACSL4F / F I / R組基因水平顯著(zhù)改變。相比之下,Cdh16Cre-ACSL4F/F組基因水平是正常的(Fig.4A). Cdh16Cre-ACSL4F/F降低了高水平的炎癥因子,包括Mmp8, Hmox1, Lcn2,Cxcl2、Cxcl1、Stat3、Cxcl3、IL-6 (Fig. 4B)。RT-PCR結果顯示,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠的腎組織中趨化因子(CCL2)和炎癥因子(IL-1βIL-6) mRNA水平顯著(zhù)降低(Fig. 4B)。RT-PCR結果顯示,Cdh16Cre-ACSL4F/F的小鼠腎組織中趨化因子(CCL2)和炎癥因子(IL-1β和IL-6) mRNA水平顯著(zhù)降低(Fig. 4C)。流式細胞術(shù)分析顯示CD11b+F4/80+巨噬細胞在Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟的浸潤明顯減少(Fig. 4D)。血常規和免疫組化實(shí)驗也顯示腎臟單核細胞減少,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠巨噬細胞浸潤減少((Fig. 4E,F)??偟膩?lái)說(shuō),敲除ACSL4可以減少I(mǎi)/ r誘導小鼠腎臟中的炎癥和巨噬細胞聚集

Fig.4 敲除腎臟ACSL4可抑制腎臟炎癥因子的釋放

 

5、鐵死亡細胞誘導巨噬細胞招募中性粒細胞

AKI小鼠中性粒細胞趨化因子顯著(zhù)升高,Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠中性粒細胞趨化因子顯著(zhù)降低(Fig.5A)。流式細胞術(shù)、血常規及免疫組化實(shí)驗證實(shí)了中性粒細胞中Cdh16Cre-ACSL4F/F下調作用(Fig. 5B–D)。因此,作者利用鐵細胞和中性粒細胞進(jìn)行體外趨化實(shí)驗,以確定中性粒細胞是否也被鐵死亡細胞招募。然而,嗜中性粒細胞不能被鐵死亡細胞吸收(Fig. 5E). 此外,鐵死亡細胞不誘導趨化因子的產(chǎn)生(Fig. 5F)。研究表明,巨噬細胞釋放趨化因子招募粒細胞到損傷部位。由于鐵細胞誘導的巨噬細胞CXCL1CXCL2的表達水平上調,巨噬細胞可能會(huì )誘導巨噬細胞招募中性粒細胞(Fig. 4H)。體外趨化實(shí)驗也顯示嗜中性粒細胞被巨噬細胞招募(Fig. 5G)。此外,嗜鐵抑制劑Fer-1下調CXCL1的表達水平, CXCL2及腎臟中性粒細胞浸潤(Fig. 5H,I)。因此,鐵細胞間接招募中性粒細胞,提供了鐵細胞在AKI中的另一種促炎作用。盡管如此,cdh16crea - acsl4F/F能有效抑制這種促炎作用。

Fig.5 巨噬細胞通過(guò)分泌中性粒細胞趨化因子來(lái)招募中性粒細胞

 

6. ACSL4抑制劑羅格列酮(Rosi) 通過(guò)抑制鐵死亡和炎癥保護AKI的腎功能

ACSL4抑制劑Rosi用于進(jìn)一步驗證ACSL4AKI中的作用。結果發(fā)現,I/R+Rosi組降低了血液CRE、腎臟指數,減輕了病理性腎臟損傷(Fig. 6A–C)。此外,Rosi下調了ACSL4、CCL2、CXCL1CXCL2的水平(Fig. 6D)。免疫組織化學(xué)和流式細胞術(shù)顯示I/R+Rosi組腎巨噬細胞浸潤較少(Fig. 6E,F)??偟膩?lái)說(shuō),這些發(fā)現表明RosiAKI有保護作用,減少炎癥細胞的浸潤,提示ACSL4AKI中發(fā)揮重要作用。

Fig. 6. ACSL4抑制劑羅格列酮(Rosi)通過(guò)抑制鐵下垂和炎癥來(lái)保護AKI患者的腎功能

 

本研究發(fā)現,ACSL4是通過(guò)抑制鐵下垂來(lái)預防和治療AKI的潛在靶點(diǎn)。HIF-1α通過(guò)結合ACSL4啟動(dòng)子,負向調控ACSL4的表達;鐵細胞招募巨噬細胞并刺激巨噬細胞招募中性粒細胞,從而引起AKI的炎癥級聯(lián)反應。本研究結果為AKI和鐵死亡相關(guān)疾病新治療方法的開(kāi)發(fā)提供了參考。

 

參考文獻:

Wang Y, Zhang M, Bi R, et al. ACSL4 deficiency confers protection against ferroptosis-mediated acute kidney injury[J]. Redox Biology, 2022: 102262.