單細胞測序揭示了乳腺癌淋巴結轉移的細胞異質性和轉錄組譜
乳腺癌淋巴結轉移的分子機制尚不清楚。通過單細胞測序，我們研究了來自15對原發(fā)腫瘤和腋窩淋巴結樣本的96796個單細胞的轉錄組譜。我們鑒定了9個癌細胞亞群，包括CD44+ / ALDH2 +/ALDH6A1+乳腺癌干細胞(BCSCs)。重要的是，BCSCs只存在于原發(fā)腫瘤中，并演化為浸潤到淋巴結的轉移瘤。此外，轉錄組數據提示，NECTIN2-TIGIT介導了轉移性乳腺癌細胞與腫瘤微環(huán)境(TME)細胞之間的相互作用，促進了免疫逃逸和淋巴結轉移。這項研究是第一次使用單細胞RNA測序描述乳腺癌淋巴結轉移的轉錄組譜。我們的發(fā)現為乳腺癌轉移的機制提供了新的見解，并對開發(fā)新的療法來抑制乳腺癌轉移的起始有意義。本文于2021年10月發(fā)表于“Oncogenesis”（IF=7.485）。
技術路線
結果
1）原發(fā)性乳腺癌和淋巴結的單細胞轉錄組分析
我們從南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院的5例患者中，在治療性手術和腋窩淋巴結清除后立即獲得組織。這些組織樣本代表來自患者同側腋窩的成對原發(fā)腫瘤和淋巴結(圖1A)。為了獲得乳腺癌的全面轉錄組情況，我們對15個樣本進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)。我們共獲得來自原發(fā)癌組織的27,028個單細胞和來自腋窩淋巴結的69,768個單細胞(圖1B)。我們將所有合格的細胞分為18種細胞類型(圖1B, C)。CD44 + / ALDH2 + /ALDH6A1 +組被定義為乳腺癌干細胞(BCSCs)。接著，我們分析樣品內部組成(圖1D)。我們還采用反褶積分析對TCGA數據庫中樣本的細胞組成進行分析，結果顯示樣本中TNBC和非TNBC細胞的比例(圖1E)。該scRNA-seq數據具有TNBC細胞的特征，這些特征后來被用于定義TCGA樣本的分子亞型。
2）乳腺癌細胞的克隆分析
為了探索乳腺癌的基因組譜，我們應用inferCNV算法分析單個細胞的拷貝數變異(CNVs)。我們發(fā)現，與其他癌細胞亞群相比，BCSCs突變較少(圖2A, B)。根據BCSCs的細胞計數，選擇患者2進行進一步研究。5個CNV_cluster被分類，CNV_cluster 5與BCSC一致(圖2C)，隨后通過UMAP可視化證實了BCSC獨特的CNV特征，并將BCSC與其他惡性細胞分離(圖2D)。根據inferCNV分析，Heatmap顯示了5個CNV_簇的突變概況(圖2E)?；贑NV突變圖譜進行進化研究和軌跡分析，推斷乳腺癌的發(fā)展過程(圖2F, G)。BCSCs在軌跡過程的早期就被識別出來，并演化為兩個癌細胞分支(圖2F)。我們的CNV圖譜在轉錄組水平上進一步證實了這一結論，CNV_cluster1和CNV_cluster4與淋巴結轉移相關的突變最多。內部組成揭示了腫瘤部位與進化狀態(tài)的關系，轉移性腫瘤細胞處于晚期，而原發(fā)病變細胞較多，處于早期(圖2H, I)。RNA-velocity證實BCSC具有干性，并根據mRNA成熟度沿其演化軌跡進行演化(圖2J)。
3）轉移性乳腺癌細胞的轉錄組特征
通過放大癌細胞，我們解剖了DEGs，分別鑒定了原發(fā)腫瘤和轉移性腫瘤細胞富集的功能和途徑。對于轉移性TNBC細胞，B2M、CD52、PTMA和GZMK是最顯著的DEGs，功能富集顯示了免疫治療的潛在敏感性，在轉移性TNBC細胞中免疫相關項目高度富集(圖3A)。對于轉移性非TNBC細胞，CXCL14、STC2、CST3和RAMP3過表達(圖3B)。我們的轉錄組圖譜顯示了腫瘤位點和分子亞型之間的異質性，Venn圖顯示了腫瘤間的相似性，在兩個TNBC和三個非TNBC樣本的轉移中發(fā)現了30個基因上調，而在兩個分子亞型中發(fā)現了103個基因下調(圖3C，D)。免疫熒光染色檢測淋巴結非TNBC細胞過表達基因(圖3F)。不同腫瘤位點和分子亞型的轉錄組差異揭示了乳腺癌腫瘤間和腫瘤內的異質性，而一些發(fā)現與其他實體腫瘤的研究結果相呼應，表明乳腺癌細胞的侵襲行為來源于淋巴結轉移。
UMAP根據乳腺癌亞型、患者、樣本來源和細胞簇對所有合格的癌細胞進行可視化(圖3E)。所有15個樣本的癌細胞被過濾后分為9個簇，其中C6具有BCSC生物標志物，包括CD44和ALDH(圖3G)。我們發(fā)現，在TNBC淋巴結轉移中，C7細胞最多，而在非TNBC淋巴結轉移中，C3細胞占多數(圖3H)。參照C7的轉錄組圖譜，CCL5、PTPRC、CD2、CXCR4和SRGN的表達靠前。富集分析旨在更好地了解腫瘤細胞簇的生物學功能，展示其在合成、代謝、細胞周期、免疫應答、信號轉導等方面的生物活性(圖3I)。據我們所知，這是第一個基于整合單細胞RNA測序從轉錄組角度揭示轉移性乳腺癌差異的研究。
4）鑒別乳腺癌的惡性程序
我們應用cNMF將腫瘤異質性的完整轉錄組譜劃分為9個元程序，并根據這些元程序的特征基因對每個腫瘤細胞簇進行評分(圖4A-C)。每個元程序對應一個具有內在相似性或相關性的基因集，包括能量代謝(元程序1;CST3, CXCL14, COX6C)，癌癥相關信號通路(元程序3;GSTP1, EMP1, TIMP-1)，免疫激活和應答(元程序5;LGALS3, PERP和EMP1)，淋巴細胞活化(元程序7; CXCR4、CD3D SRGN)，t細胞活化和DNA修復(元程序9;RICTOR、GZMK IFI16)。元程序可以更好地理解乳腺癌分子亞型和腫瘤部位的異質性和相似性。C3在元程序 1中得分較高。根據功能富集(圖4D, E)，該元程序富集了物質代謝和ERBB2信號通路。與轉移性非TNBC細胞不同，該元程序分析表明，轉移性TNBC細胞在激活淋巴結的免疫識別中具有活性(圖4B、D和E)。元程序 7中富集的最重要功能包括淋巴細胞分化和激活，以及淋巴細胞介導的免疫。元程序9富集的主要功能包括t細胞受體信號通路、腫瘤中PD-L1表達和PD-1 checkpoint通路、PI3K-Akt信號通路。
為了證明TME中免疫細胞的轉錄組特征，我們使用UMAP可視化來自5個原發(fā)病灶和10對腋窩淋巴結的所有免疫細胞(圖5A，B)。TME在腫瘤部位的細胞組成和基因表達上都存在差異(圖5C，D)。與淋巴結內的免疫細胞相比，免疫細胞浸潤到原發(fā)腫瘤細胞時的生物活性更強烈，并且在不同分子亞型的轉移中免疫反應的功能差異顯著(圖5D，E)。基于多細胞相互作用網絡分析工具包(NATMI)分析，我們識別了不同樣品來源的細胞類型之間的細胞間通信(圖6A-F)。轉移性癌細胞和免疫細胞之間的配體-受體對是淋巴結TME的重要組成部分。CD52-SIGLEC10和PTPRC-CD22參與了TNBC和非TNBC淋巴結轉移(圖6G, H)?；诹馨徒Y內癌細胞與免疫細胞間的DEGs和通信，我們的研究結果不僅解釋了乳腺癌細胞在不同部位的免疫逃逸機制，也為未來針對淋巴結轉移惡性過程的治療提供了靶點(圖6I)。通過與TIGIT相互作用，我們發(fā)現NECTIN2在轉移性非TNBC細胞中高表達，通過與TIGIT相互作用，發(fā)現轉移性癌細胞抑制T細胞激活，抑制免疫應答。我們進一步進行免疫熒光染色，證實了癌細胞與CD8+效應T細胞之間的細胞-細胞相互作用(圖6J)。
結論：我們描述了乳腺癌干細胞的特征，描述了腫瘤發(fā)生的進化過程，確定了乳腺癌轉移特異性亞簇的轉錄組譜，并詳細地證明了腫瘤內部和腫瘤間的異質性。本研究為乳腺癌淋巴結轉移的進一步研究提供了新的思路，為乳腺癌患者的個體化治療奠定了基礎。
參考文獻：Xu K, Wang R, Xie H, Hu L, Wang C, Xu J, Zhu C, Liu Y, Gao F, Li X, Wang C, Huang J, Zhou W, Zhou G, Shu Y, Guan X. Single-cell RNA sequencing reveals cell heterogeneity and transcriptome profile of breast cancer lymph node metastasis. Oncogenesis. 2021 Oct 5;10(10):66. doi: 10.1038/s41389-021-00355-6. PMID: 34611125; PMCID: PMC8492772.